Research Progress of CRISPR/Cas9 Gene-editing System In Rice Breeding

Gu Shuang ¹　Zheng Wenjing ²　Ma Dianrong ^1*

1 Rice Research Institute/Key Laboratory of Northeast Rice Biology and Breeding, Ministry of Agriculture/Key Laboratory of Northern Japonica Super Rice Breeding, Ministry of Education, Shenyang Agricultural University, Shenyang, 110161; 2 Liaoning Rice Research Institute, Shenyang, 110101

* Corresponding author, madianrong@syau.edu.cn

Abstract　The adverse effects of soil degradation, climate change, biotic stress and abiotic stress pose new challenges to the security and stability of food production in China. In order to realize the goal of rice breeding, it is urgent to integrate molecular breeding techniques in rice breeding. CRISPR/Cas9 gene-editing system has the advantages of short time cycle, simple and fast operation and high editing efficiency. It has become an important tool in plant science and rice molecular breeding, and has been widely used in the creation and genetic improvement of rice germplasm resources. Based on the work principle of CRISPR/Cas9 gene-editing system, this study summarized the research progress of CRISPR/Cas9 system in rice plant architecture improvement, production improvement, quality improvement, disease resistance and stress resistance improvement, rice male sterile line creation and asexual reproduction, and prospected the application prospect of gene editing system in rice breeding in Northeast China.

Keywords　Gene-editing, CRISPR/Cas9, Rice (Oryza sativa L.), Molecular breeding

水稻(Oryza sativa L.)是人类重要的粮食作物，对生长环境具有很强的适应性，甚至可以在不适合其他作物生长的地区生长。然而，由于受到气候变化、生物和非生物胁迫以及人口激增等因素的影响，水稻生产安全面临巨大挑战。因此，在育种改良中结合分子技术手段，加速培育高产作物新品种，提高作物对生物和非生物胁迫的耐受性(Delorge et al., 2014)，是保障现在和未来粮食生产稳定安全的有效途径。近年来，以CRISPR/Cas9为代表的精准基因编辑技术得到快速发展，在产量(Li et al., 2016b; Ma et al., 2019; Zhou et al., 2019)，品质(Sun et al., 2017; 邵高能等, 2017; 杨平等, 2020)，抗性(Lou et al., 2017; 徐鹏等, 2019; Kuang et al., 2020)等方面取得了一系列的重要进展，表明该技术在水稻育种改良有着巨大的应用价值，可加速育种的定向变异和进化。本研究中，笔者对前人的研究成果进行了系统汇总分析，以期望在水稻分子育种中提供帮助。

1 CRISPR/Cas9系统简介

1.1 CRISPR/Cas9系统工作原理

CRISPR/Cas9是细菌和古细菌在长期演化过程中形成的一种适应性免疫防御机制(Jinek et al., 2012)。当细菌受到噬菌体等外源DNA侵染时，细菌的前导区率先反应并发生应答,同时诱导和调控CRISPR转录为长链RNA前体(Pre CRISPR RNA, pre-crRNA)，长链pre-crRNA被截断成为短的成熟crRNA (CRISPR-derived RNA)，接下来crRNA与tracrRNA (trans-activating RNA)精确结合并融合为tracrRNA/crRNA复合物(Bhaya et al., 2011)。复合物调控引导核酸酶Cas9蛋白，最终精准剪切DNA双链(Brendel et al., 2014)。通过人工设计这两种RNA,可以改造形成与tracrRNA/crRNA复合物同样具有引导作用的sgRNA (short guide RNA)，其可以引导Cas9蛋白对DNA的目标位点精确切割(Jinek et al., 2012)，DNA双链发生断裂(double strand breaks, DSBs)。DSBs以非同源末端连接(non-homologous end joining, NHEJ)或同源重组(homology directed repair, HDR)进行修复。NHEJ的修复方式容易发生错误，断裂位置会产生小片段的缺失或插入，从而产生基因突变；在供体DNA存在的情况下，断裂位置会通过HDR方式进行修复，引入精准的碱基插入或替换(图1)。

图1 CRISPR/Cas9 基因编辑系统的工作机制 Figure 1 Molecular mechanism underlying CRISPR/Cas9 gene-editing system

1.2 CRISPR/Cas9系统的技术优势

CRISPR/Cas9技术作为新兴的基因组编辑方法，在作物遗传育种方面有着无可取代的地位。CRISPR/Cas9技术只通过编辑内源基因完成遗传基因改良，全过程中只有RNA和蛋白质作为效应分子，后代中很容易筛选出没有外源基因整合的编辑材料，避免了传统转基因方法导致的公众和舆论关切的食品安全问题，使作物改良过程更为迅速并容易被接受。CRISPR/Cas9技术可以实现基因组的定点编辑，而不影响基因组中的其他位点，并有望在DNA修复系统的作用下实现特定位点的精确突变，而且效率更高。

但是，CRISPR/Cas9技术在应用过程中仍然存在很多问题。比如，脱靶会引起基因组非靶向位点的突变，从而引起研究结果的不确定性。再者，如何通过HDR修复途径提高基因编辑效率和实现大片段插入和碱基替换也是面临的一个挑战。

2 CRISPR/Cas9技术在水稻育种中的应用

2013年多篇CRISPR/Cas9基因编辑技术在植物育种上成功应用文章的发表(Jiang et al., 2013; Nekrasov et al., 2013; Shan et al., 2013)，预示着CRISPR/Cas9基因编辑技术在植物中正式得以应用。近年来，CRISPR/Cas9基因编辑技术得到快速发展，已广泛用于作物的种质资源创制(Li et al., 2016c; Zhou et al., 2016; Kuang et al., 2020)、遗传改良(王加峰等, 2016; Farhat et al., 2019; Zhou et al., 2019)。基因编辑技术在水稻中的应用，已经成为解析水稻基因功能和分子机理的重要工具。

2.1 CRISPR/Cas9在水稻株型改良方面的应用

水稻株型的好坏与产量高低和品质优劣有着重要的关系。水稻株型的构成因子主要有株高、叶型、分蘖数、分蘖角度和穗型。胡雪娇等(2018)利用CRISPR/Cas9系统靶向编辑半矮秆基因SD1，sd1突变体株高大约下降了25%。Li等(2016)利用CRISPR/Cas9技术以中花11为材料靶向编辑直立穗型基因DEP1和理想株型基因IPA1，dep1突变体植株性状表现为穗型直立紧凑；ipa1突变体则表现为分蘖数或减少或增加，呈现两种极端表现。

2.2 CRISPR/Cas9在水稻产量提高方面的应用

粒重是水稻产量构成的重要性状，与有效穗数和每穗粒数共同构成水稻产量三要素，是多基因控制的数量性状位点。Zhou等(2019)敲除3个水稻品种中粒长基因GS3，GS2和每穗粒数基因Gn1a，发现三基因突变有叠加增产效应。Xu等(2016)敲除水稻千粒重基因粒重基因GW2、GW5和千粒重多基因TGW6后，得到gw2gw5tgw6 和gw2gw5 纯合突变体，发现突变体粒长、粒宽和粒重都显著增加。OsSNB参与植物发育调控，尤其是花器官的发育(Lee et al., 2007)。Ma等(2019)通过CRISPR/Cas9技术敲除OsSNB基因，突变体的粒长、粒宽和千粒重都增加，说明OsSNB不仅可以调控花器官发育，在控制水稻粒型方面也有重要作用.

抽穗期是影响水稻产量的重要因素，水稻抽穗是指从营养生长转化到生殖生长的关键阶段。Li等(2017)对黑龙江不同品种的Hd2、Hd4、Hd5同时进行突变，有效缩短突变体抽穗期。

2.3 CRISPR/Cas9在水稻品质改良方面的应用

直链淀粉(amylose, AM)和支链淀粉(amylpectin, AP)是稻米淀粉的两种类型，二者的组成比例决定了稻米的食用品质和加工品质。MA等(2015)通过敲除水稻蜡质基因Wx，成功将突变体AM含量由14.6%降至2.6%，获得糯性稻米。淀粉分支酶(starch branching enzyme, SBE)基因控制支链淀粉的合成。在SBE突变的作物中，直链淀粉(AM)和抗性淀粉(resistant starch, RS)含量升高(朱霁晖等, 2015)。白建江等(2018)对淀粉分支酶SBE3基因进行编辑，突变体中抗性淀粉含量由0.48%增至10%以上，从而获得高抗性淀粉水稻新品系。Sun等(2017)利用CRISPR/Cas9技术敲除淀粉分支酶基因SBEⅡb，SBEⅡb，突变体的RS含量由低于1%提升至9.8%。

水稻香味是水稻最重要的食味品质之一，一直受到育种家的重视。2－乙酰－1—吡咯啉(2-AP)是香稻中主要的挥发性物质之一，Badh2基因在编码区和调控区域发生突变时，会引起2-AP前体物质增加，进而积累2-AP，水稻从而产生香味(彭波等, 2017)。杨平等(2020)利用CRISPR/Cas9技术构建双靶点编辑Badh2基因，突变体中香味物质2-AP含量显著增加，香味浓淡有2-AP含量正相关。

2.4 CRISPR/Cas9在水稻抗性提升方面的应用

水稻病害严重影响水稻的优质高产，培育优质抗病水稻品种是育种家研究和选育的重点之一。赵开军等靶向敲除空育131中抗稻瘟病基因OsERF922，在苗期和分蘖期，突变体的稻瘟病抗性都增强。周焕斌团队(任斌等, 2017)利用单碱基编辑技术靶向编辑抗稻瘟病基因pi-ta，突变效率为18%。徐鹏等(2019)利用CRISPR/Cas9技术实现Pi21、OsERF922、Pita三基因突变，突变体对部分稻瘟病生理小种抗性显著增强。

CRISPR/Cas9基因编辑系统在提升水稻对非生物胁迫耐受力的方面得到广泛应用。在水稻耐旱方面，Lou等(2017)靶向编辑OsSAPK2基因，纯合T1代OsSAPK2突变体对ABA不敏感，对干旱胁迫更敏感，证实OsSAPK2具有提高水稻耐旱性的功能。在水稻耐冷方面，Shen等(2017)利用CRISPR/Cas9技术靶向编辑OsAnn3基因，相比野生型，获得的6株突变体株系对低温都更加敏感。

CRISPR/Cas9基因编辑技术在改良水稻对除草剂的抗性方面也得到广泛应用。Li等(2016)以日本晴为材料敲除EPSPS基因，成功获得具有除草剂草甘膦抗性植株。ALS是一种乙酰乳酸合成酶，参与合成植物支链氨基酸。周焕斌团队(Kuang et al., 2020)利用单碱基编辑技术，实现了OsALS1和OsACC基因的饱和突变，成功创制具有除草剂抗性的水稻品种南粳46。

2.5 CRISPR/Cas9在水稻育性改良方面的应用

水稻两系不育系分为光敏核不育系(PGMS)和温敏核不育系(TGMS)(吴明基等, 2018)。张大兵等利用CRISPR/Cas9技术靶向敲除空育131花粉碳饥饿基因CSA，csa突变体在短日照下呈现完全雄性不育，长日照条件下表现出雄性可育,从而创制出光敏核雄性不育突变体。黄忠明等(2018)靶向敲除水稻温敏不育基因TMS5，tms5突变体在高温条件下完全雄性不育，低温条件下雄性可育，且证实tms5突变体花粉育性的转换温度为28℃，但突变体的结实率和单株重都有所下降。

CRISPR/Cas9技术在实现水稻无性繁殖，固定杂种优势方面发挥出巨大优势作用(表1)。Sundaresan团队(Khanday et al., 2019)靶向敲除BBM1、BBM2、BBM3基因，同时在卵细胞中异位表达BBM1基因，诱导水稻产生孤雌生殖，利用有丝分裂替代减数分裂，从而实现水稻种子的无性繁殖。王克剑团队研究证实，多重编辑减数分裂基因REC8、PAIR1和OSD1，可以产生二倍体配子和四倍体种子，编辑参与受精的MTL基因可以诱导产生杂交水稻中的单倍体种子。利用此方法将种子克隆繁殖从而固定F1代杂交水稻的杂种优势有望实现，对农业生产具有革命性意义。

表1 CRISPR/Cas9技术在水稻育种中应用 Table1  Applications of CRISPR/Cas9 in rice breeding

3 CRISPR/Cas9在水稻育种中的应用前景

CRISPR/Cas9系统作为新兴的基因组编辑技术，在作物遗传育种和性状改良方面有着无可取代的地位。在产量和品质改良方面，培育既能保障水稻产量，又能满足消费者需求的水稻品种，兼具高产量和适口性的特点，依赖于自然突变和随机突变的常规育种技术很难实现。随着基因组、转录组学等一系列分子生物技术的应用与发展，调控水稻产量、品质的分子机制研究的不断深入，越来越多的与产量、品质相关的基因被定位和克隆，CRISPR/Cas9技术为实现多个优良基因聚合的育种目标提供了可能性。东北大米米质好、食味品质优良，在市场上广受好评。但是由于受到气候、生物胁迫等因素影响，东北大米的产量受到严重威胁。如何发挥CRISPR/Cas9聚合多个高产水稻基因的技术优势，在提高东北水稻产量的前提下，同时保障其本身的食味品质不受影响，是目前研究者们需要关注的重点。同时，通过CRISPR/Cas9系统改良北方水稻株型，获得光合利用率高的理想株型，是挖掘北方水稻产量潜力的有效途径之一。CRISPR/Cas9技术是克服高产、优质水稻育种障碍的有效途径。

应对水稻生物胁迫和非生物胁迫不利影响时，提高水稻对不利环境的耐受力是行之有效的方法。采用常规育种手段获得有利基因的过程往往耗费时间长，劳动强度大。通过CRISPR/Cas9系统培育抗性水稻品种，应对不利环境是一种高效、简单的方式。盐碱胁迫和冷害胁迫是东北稻区普遍的非生物胁迫，对水稻的整个生长周期都会产生影响，严重制约东北水稻的产量和品质。利用CRISPR/Cas9技术将耐盐碱、耐冷害的优良抗性基因引入东北水稻，获得抗性优良、高产、优质的水稻新种质，为解决东北局部地区因高盐高碱和低温冷害，导致种植面积缩小，水稻产量低下，品质差的问题提供了新的思路。在解决生物胁迫方面，稻瘟病是影响东北稻区的主要病害，然而稻瘟病的致病机理复杂，病菌生理小种的变异多样，所以选育抗病周期长，抗性稳定的品种十分重要。利用CRISPR/Cas9技术获得抗稻瘟病水稻新品种对于解决这个问题有重要意义。CRISPR/Cas9系统是培育优良抗性水稻品种的有利手段。

但是，如何确定更多优异靶标基因及组合应用，如何提高Cas9编辑效率及精确碱基变异和片段置换，并在更广泛的植物材料中实现快速编辑仍是亟待解决的问题。但是，相信在不久的将来，随着CRISPR/Cas9系统的进一步优化和改良，在作物改良与培育新品种方面会发挥其无可取代的作用。

作者贡献

顾爽负责本综述初稿的相关文献资料查阅、整理和撰写；郑文静参与讨论和论文的修改；马殿荣是综述的通讯作者和负责人，指导论文写作与修改。全体作者都阅读并同意最终的文本。

致谢

本研究由辽宁省“兴辽英才计划”项目(XLYC1808003)资助。

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